生殖隔离是指 由于各方面的原因，使亲缘关系接近的类群之间在自然条件下不交配，或者即使能交配也不能产生后代或不能产生可育性后代的隔离机制。若隔离发生在受精以前，就称为受精前的生殖隔离，其中包括地理隔离、生态隔离、季节隔离、生理隔离、形态隔离和行为隔离等；若隔离发生在受精以后，就称为受精后的生殖隔离，其中包括杂种不活、杂种不育和杂种衰败等。
生殖隔离是物种形成的关键，是物种形成的最后阶段，是物种间真正的界线。它保持了物种间的不可交配性，从而也保证了物种的相对稳定性。生殖隔离一旦形成，原来的一个物种的种群就变成两个物种的种群了。
例如，美国科罗拉多大峡谷两侧的Kaibab松鼠与Abert松鼠，原先就是一个物种，后因大峡谷河流的形成，它们的祖先被分为两个隔离的种群，最后形成了今天的样子。此外，人类和猩猩虽然染色体数目不同，推测存在生殖隔离，但目前还没有具体的研究证明这一点。